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TLC测定黄曲霉毒素B1(一)
【来源/作者】周世红 【更新日期】2018-09-27

一、原理

根据黄曲霉毒素B1能在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光的特性,采取薄层色谱法(TLC),将样品经提取、浓缩、薄层分离后,利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。

二、试剂

石油醚:沸程30~60℃;正己烷;氯仿;苯;乙腈;甲醇;无水乙醚;丙酮;无水硫酸;钠硅胶G。

苯-乙腈混舍液:取苯98mL,乙腈2mL,混匀,冰箱存放备用。

黄曲霉毒素消毒剂:5%次氯酸钢溶液,lOOg漂粉精,加入500mL水,搅匀;另溶解70g碳酸钠(Na2C03·H20)于500mL温水中,溶解后,倒入上述溶液中搅匀,澄清、过滤,备用。

黄曲霉毒素标准溶液制备如下。

①标准储备液(1.02μg/mL):GBW(E)090015严格控制,应加锁于冰箱中避光存放。每次记录用量、余量,以备复查。

①释液I(0.2μg/mL):取储备液加苯-乙腈混合液稀释。

③稀释液Ⅱ(0.04μg/mL):取稀释液I lmL,以苯-乙腈混合液稀释。

三、仪器

小型粉碎机;分样筛一套;电动振荡器;电吹风机;薄层板涂布器(可以自制);玻璃板:5cm×20cm;展开槽;紫外光灯;微量进样器;电热恒温水浴。

四、操作方法

1、提取

①适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。

称取经过粉碎(20目筛)的样品20g于250mL具塞三角烧瓶中,加正己烷30mL,甲醇水(55:45)lOOmL,加塞后加水少许,盖严防漏,振荡30min,静置片刻,以脱脂棉过滤于分液漏斗中,待分层,放出下层的甲醇水溶液20raL(相当于样品4g)于另一分液漏斗中,加氯仿20mL,振摇2min,静置分层。另备一漏斗,底部铺脱脂棉少许,再加无水硫酸钠10g,下接60mL蒸发皿,漏斗中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的漏斗中,过滤,再加5mL氯仿于分液漏斗中,分层后一并滤于同一蒸发皿中,最后用少量氯仿洗涤滤器,洗液并入以上蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱内于65℃水浴上通风挥干,然后放在水浴上冷却2~3min,准确加入苯-乙腈lmL。用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合,若有结晶析出(苯),将蒸发皿从水浴上取下,继续溶解,混合,晶体消失,再用此管吸取上清液,转移于2mL样液瓶中,若溶液不够澄清,应离心,或放置等候澄清,取上清液供薄层点板用。

注意:加入氯仿,振摇2min,如出现乳化现象,可滴加甲醇促使分层,或用电吹风机吹热风促使分层。

含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取,即称取粉碎样品20g移于滤纸筒内,筒内塞少量脱脂棉,置于250mL脂肪提取器内,在75~85℃水浴上以石油醚提取脱油8h,然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于250mL具塞三角烧瓶内,进行检验。

如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取:称取粉碎过筛样品20g于250mL具塞三角烧瓶内,用滴管滴加6mL水,使样品湿润,并准确加入氯仿60mL,振荡30min,加无水硫酸钠12g,振摇,静置30rain;以脱脂棉过滤,取滤液12mL(相当于样品4g)于蒸发皿中,以下步骤与上述“将蒸发皿放入通风橱内于650C水浴上通风挥干……”同。

②适用于花生油、香油、菜子油等。

称取样品4g于小烧杯中,用正己烷20mL转移于125mL分液漏斗中,再用甲醇水(55+45)20mL分数次洗涤小烧杯,洗液一并移入分液漏斗中,振摇2min,静置分层后,将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中,原分液漏斗中再加甲醇水5mL,振荡提取一次,甲醇水溶液一并移入第二个分液漏斗中,在第二个分液漏斗中加入氯仿20mL,振摇2min,静置分层后按①操作。

③适用于酱油、醋,方法有以下两种。

第一,称取样品10g于小烧杯中,为防止提取时乳化,加氯化钠4g,移于分液漏斗中,烧杯用氯仿15mL分次洗涤,洗液一并移于分液漏斗中,振摇2min,静置分层后按①操作。最后加入2.5mL苯-乙腈溶解,此液每lmL相当于样品4g。

第二,称取样品10g移于分液漏斗中,加甲醇12mL(以酱油代替水,故甲醇与水体积比仍约为55+45),加氯仿20mL提取,振摇2min,静置分层后按①操作。最后加苯-乙腈2.5mL,每lmL相当于样品4g。

④适用于酱类(包括豆乳制品)。

称取样品20g于250mL具塞三角烧瓶中,加正己烷20mL与甲醇水50mL,振荡30min,静置片刻,以脱脂棉过滤,滤液静置分层后,取甲醇水24mL于分液漏斗中,加入氯仿20mL,振荡2min,静置分层后按①操作。最后加入苯-乙腈2mL,每1mL相当于样品4g。

注:以上检品极易乳化,实在分不开层时,可采用离心分层的办法。

⑤用于发酵酒类。

称取样品10g于小烧杯中,以氯仿15mL分次洗于分液漏斗中,振摇2min,静置分层后按①操作。最后加入苯-乙腈2.5mL,此溶液每lmL相当于样品4g。

⑥用发酵用曲种及菌株。

称取样品10g于具塞三角烧瓶中,加入正己烷30mL与甲醇水(55+45)80mL,振荡0.5h,用脱脂棉过滤于分液漏斗中,取出甲醇水溶液32mL(相当于样品4g)于另一分液漏斗中,加入30mL氯仿提取,振摇2min,静置分层后按①操作。

2、薄层色谱分析(单向展开法)。

(1)薄层板的制备:一般现在用成品硅胶板。如需自己制板,方法如下。

称取硅胶G约3g(或称取硅胶85g与石膏粉15g,充分混合均匀后称取3g),加相当于硅胶2~3倍的水,在玻璃乳钵中研磨1~2min,至成均匀的糊状后立即倒入涂布器内,推成5cm×12cm、厚约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min后,放入烘箱内l000C活化2h,取出放入干燥器内保存,一般在干燥器内可保存2~3d。若放置时间较长,则应重新活化。

(2)点样:将薄层板边缘上附着的吸附剂刮净,在距薄层板下端3cm的基线上,用进样器滴加样液,一块可以滴加4个点,点距边缘和点间距离约为1cm,点直径应掌握在3mm以内为好,在同一板上滴加的点应大小一致。在滴加样液的时候,可用吹风机吹冷风边吹边点。

参考资料:食品检测验证手机自动送彩金59


【关键词】黄曲霉毒素,食品检测国家标准物质网 

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